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May 10, 2023

Descoberta de duas novas isoformas do gene DUT humano

Relatórios Científicos volume 13,

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7760 (2023) Citar este artigo

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Em células humanas foram descritas duas isoformas de dUTPase: uma nuclear (DUT-N) e uma mitocondrial (DUT-M), com sinais de localização cognatos. Em contraste, aqui identificamos duas isoformas adicionais; DUT-3 sem nenhum sinal de localização e DUT-4 com o mesmo sinal de localização nuclear do DUT-N. Com base em um método de RT-qPCR para quantificação específica de isoforma simultânea, analisamos os padrões de expressão relativa em 20 linhagens de células humanas de origens altamente diferentes. Descobrimos que a isoforma DUT-N é expressa de longe no nível mais alto, seguida pela isoforma DUT-M e DUT-3. Uma forte correlação entre os níveis de expressão de DUT-M e DUT-3 sugere que essas duas isoformas podem compartilhar o mesmo promotor. Analisamos o efeito da privação de soro na expressão de isoformas dUTPase em comparação com células não tratadas e descobrimos que os níveis de mRNA de DUT-N diminuíram em células A-549 e MDA-MB-231, mas não em células HeLa. Surpreendentemente, após a privação de soro, DUT-M e DUT-3 mostraram um aumento significativo na expressão, enquanto o nível de expressão da isoforma DUT-4 não apresentou nenhuma alteração. Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que o suprimento de dUTPase celular também pode ser fornecido no citoplasma e as alterações de expressão induzidas pelo estresse de fome são dependentes da linhagem celular.

As polimerases não podem distinguir entre dUTP e dTTP, pois diferem em apenas um grupo metil, portanto, manter a proporção apropriada de dUTP/dTTP é de extrema importância1. A enzima dUTPase é responsável por preservar a integridade do genoma ao catalisar a hidrólise do dUTP em dUMP e pirofosfato, eliminando assim o dUTP do dNTP pool2,3. Se dUTP estiver disponível, o uracil incorporado é clivado pelas uracil-DNA glicosilases como parte do mecanismo de reparo por excisão de base4. O nível elevado de dUTP pode levar à morte celular sem timina por meio da superativação do processo de reparo do DNA5. Para evitar isso, é necessária a atividade da enzima dUTPase. O outro papel da reação catalisada pela dUTPase é produzir dUMP, que é um substrato para a timidilato sintase na via de síntese de novo dTTP.

Até o momento, duas isoformas de dUTPase humana foram descritas na literatura, que se localizam no núcleo e na mitocôndria, respectivamente, presumivelmente para garantir a regulação do pool de dUTP nessas duas organelas contendo DNA6. As duas isoformas são codificadas pelo gene DUT e geradas pelo uso do promotor alternativo juntamente com o splicing alternativo7,8. As duas isoformas diferem apenas no primeiro éxon, pois a isoforma mitocondrial (DUT-M) contém uma sequência de direcionamento mitocondrial, enquanto a isoforma nuclear (DUT-N) contém um sinal de localização nuclear7,9,10. As duas isoformas da dUTPase foram descritas por Ladner et al. com análise de Northern e Western Blot nos níveis de mRNA e proteína, respectivamente7. Os níveis de expressão de RNA das isoformas em fibroblastos de pulmão humano 34Lu também foram investigados sob privação de soro, que força as células a sair do ciclo celular e entrar em um estado de repouso. Segundo Ladner et al., essa transição leva a uma diminuição drástica na expressão da isoforma DUT-N dUTPase, sem alterar o nível da isoforma DUT-M.

Estudos recentes de sequenciamento de alto rendimento previram a presença putativa de duas isoformas adicionais em humanos, denominadas como DUT-3 (UniProt ID: A0A0C4DGL3, NCBI RefSeq ID: NM_001025249.1) e DUT-4 (UniProt ID: H0YNW5, NCBI RefSeq ID: NM_001330286.2) no presente trabalho. Bancos de dados de sequência sugeriram que a terceira isoforma sugerida (DUT-3) não contém nenhum sinal de localização, portanto, provavelmente é retida no citosol. A parte upstream da região 5'UTR do DUT-3 é idêntica à do DUT-M, no entanto, a sequência líder mitocondrial - presente no primeiro éxon da isoforma DUT-M - está ausente da isoforma DUT-3. A quarta isoforma sugerida (DUT-4) foi prevista para se assemelhar muito à isoforma DUT-N, diferindo apenas em alguns aminoácidos no N-terminal. O primeiro éxon desta isoforma está localizado a montante das outras isoformas no genoma, portanto, sua expressão pode ser conduzida por um promotor alternativo para uma potencial regulação alterada desta isoforma. Ainda não foram relatados dados sobre os níveis de expressão fisiológica ou função(ões) dessas duas novas isoformas de dUTPase humana.