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May 12, 2023

Mapeamento de oligonucleotídeos por espectrometria de massa para permitir a caracterização abrangente da estrutura primária de uma vacina de mRNA contra a SARS

Relatórios Científicos volume 13,

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 9038 (2023) Citar este artigo

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O mapeamento de oligonucleotídeos por cromatografia líquida com detecção UV acoplada à espectrometria de massa em tandem (LC-UV-MS/MS) foi desenvolvido recentemente para apoiar o desenvolvimento de Comirnaty, a primeira vacina comercial de mRNA do mundo que imuniza contra o vírus SARS-CoV-2. Análogo ao mapeamento de peptídeos de modalidades de proteínas terapêuticas, o mapeamento de oligonucleotídeos aqui descrito fornece caracterização direta da estrutura primária do mRNA, por meio de digestão enzimática, determinações de massa precisas e fragmentação otimizada induzida por colisões. A preparação da amostra para o mapeamento de oligonucleotídeos é uma digestão rápida, em um recipiente e com uma enzima. A digestão é analisada via LC-MS/MS com um gradiente estendido e a análise de dados resultante emprega software semiautomatizado. Em um único método, as leituras de mapeamento de oligonucleotídeos incluem um cromatograma UV altamente reprodutível e completamente anotado com 100% de cobertura máxima de sequência e uma avaliação de microheterogeneidade do limite do terminal 5' e do comprimento da cauda poli(A) do terminal 3'. O mapeamento de oligonucleotídeos foi fundamental para garantir a qualidade, segurança e eficácia das vacinas de mRNA, fornecendo: confirmação da identidade do construto e estrutura primária e avaliação da comparabilidade do produto após alterações no processo de fabricação. Mais amplamente, esta técnica pode ser usada para interrogar diretamente a estrutura primária de moléculas de RNA em geral.

Duas vacinas de RNA mensageiro (mRNA), Comirnaty da Pfizer-BioNTech e Spikevax da Moderna, foram aprovadas pelo FDA, EMA e outras agências reguladoras em todo o mundo para combater a pandemia da doença de coronavírus 2019 (COVID-19)1,2. O COVID-19 é causado pela infecção por coronavírus-2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)3. As vacinas de mRNA podem ser utilizadas para imunização, pois contêm as instruções genéticas para a autotradução da proteína imunogênica alvo4. O mRNA em vacinas COVID-19 aprovadas codifica a proteína S-2P5, que difere da proteína spike SARS-CoV-2 por duas mutações estabilizadoras de prolina que geram uma conformação de pré-fusão6.mRNA, a substância medicamentosa (DS) é fabricada por transcrição in vitro ( IVT) usando bacteriófago T7 polimerase com N1-metil pseudouridina formando um RNA mensageiro modificado por nucleosídeo (modRNA). O modRNA DS é subsequentemente encapsulado com nanopartículas lipídicas (LNPs) para entrega celular e proteção contra forças degradativas. Os modRNA-LNPs formulados compreendem o medicamento (DP) que é administrado para vacinação.

Os fabricantes de medicamentos têm a responsabilidade absoluta de caracterizar e entender a estrutura molecular, a sequência, a heterogeneidade e as impurezas dos medicamentos e vacinas finais que comercializam. A estrutura primária geral do mRNA DS, da extremidade 5' para a extremidade 3', é: 5' Cap, 5' região não traduzida (UTR), região de codificação de antígeno, 3' UTR e cauda de poliadenosina 3' (poly(A) -tail)7 em um formato de cadeia simples. Para ser competente para tradução, o mRNA deve ser limitado em sua extremidade 5'8 e ter uma cauda poli(A) com um número suficiente de nucleotídeos de adenosina consecutivos9. O cap 5' é frequentemente um trifosfato de guanosina metilado N7 terminal 5' conectado ao carbono 5' da ribose do próximo nucleotídeo de adenosina ou guanosina, que também pode ser metoxilado em seu carbono 2'10. Esses atributos 5' cap e poly(A)-tail também conferem estabilidade ao proteger o mRNA dos processos de degradação celular11,12. A integridade da estrutura primária de mRNA de comprimento total, incluindo o cap 5' e os terminais poly(A)-tail, representam atributos de qualidade críticos para a vacina DS que são monitorados de perto para garantir a qualidade desejada do produto.

Múltiplas técnicas de "mapeamento de oligonucleotídeos" cromatográficas e eletroforéticas foram desenvolvidas nas últimas décadas13,14,15. Mais recentemente, métodos de caracterização de mRNA baseados em espectrometria de massa (MS) utilizando cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa de par iônico acoplado a espectrometria de massa (IP RP-HPLC-MS) foram desenvolvidos para caracterização aprofundada de vacinas de mRNA' 5' Cap16 e 3'-Poly(A)-tail17. No entanto, estes requerem purificação e métodos analíticos dedicados para caracterização de cada terminal. Métodos analíticos adicionais utilizando digestões enzimáticas e IP RP-HPLC com e sem tandem MS (MS/MS) para sequenciamento de oligonucleotídeos de RNA grande foram recentemente desenvolvidos18,19,20,21,22. Várias enzimas22 em solução, ou RNase T1 imobilizada em partículas magnéticas, foram avaliadas para melhorar a cobertura da sequência. Nakayama et ai. desenvolveu um método de criação de perfil de mRNA baseado em LC-MS usando padrões marcados com isótopos estáveis. Apesar do trabalho pioneiro na caracterização da estrutura primária do RNA discutido anteriormente18,19,20,21,22, é benéfico para o campo ter um método analítico que seja abrangente e simples de empregar. Um mapa de oligonucleotídeos ideal para implementação direta é aquele capaz de caracterizar direta e eficientemente todo o comprimento do RNA, incluindo 5' Cap e heterogeneidade do terminal 3', em uma digestão de uma enzima em um pote, sem a necessidade de marcação de isótopos estáveis controles. Ele resolve isômeros de sequência e produz um cromatograma UV totalmente anotado com um mapa de cobertura máxima de sequência.